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廣東獸藥期刊《串珠鐮刀菌素對雞血清白介素-2含量的影響》
發(fā)布時間:13/05/18
串珠鐮刀菌素對雞血清白介素-2含量的影響
黃慶敏1 李家松1 藍(lán)向波2
(1、廣東省佛山市獅山鎮(zhèn)農(nóng)林服務(wù)管理中心 2、廣州市興達(dá)動物藥業(yè)有限公司 廣東南海 528222)
前言
在全球范圍內(nèi),串珠鐮刀菌(Fusarium monili-forme)是污染玉米等糧食作物的主要真菌,能產(chǎn)生多種毒素并給人類和
動物造成很大的危害。串珠鐮刀菌素(Moniliformin,MON)是從串珠鐮刀菌培養(yǎng)物中分離到的一種真菌毒素。該毒
素在自然界分布廣泛,目前已知有十余種鐮刀菌可產(chǎn)生MON,最高產(chǎn)毒量達(dá)33.7 g/kg。研究表明,MON對人和動物有
很強(qiáng)的毒性,并以心血管系統(tǒng)損害為特征 .
MON可由十多種鐮刀菌產(chǎn)生,這些鐮刀菌在自然界分布廣泛,主要引起麥穗、谷粒及玉米等霉變,并能在
燕麥、大豆、高粱、大麥、小米、小麥及土壤中生長。影響毒素產(chǎn)生的因素很多,但絕對MON產(chǎn)生及產(chǎn)量的主要
因素有菌株、基質(zhì)、溫度和時間等。同一菌株,不同的菌株,產(chǎn)毒量也不同。培養(yǎng)基質(zhì)不同,產(chǎn)毒量有差異,
玉米?;|(zhì)產(chǎn)毒量最高。
MON產(chǎn)生菌一般在25℃21d培養(yǎng)為宜,但鐮型鐮刀菌在34℃時產(chǎn)毒量最高,另外培養(yǎng)過程中間段性低溫可誘導(dǎo)
產(chǎn)毒。
大自然存在MON主要污染玉米等糧食作物,在自然界污染嚴(yán)重。MON為淺黃色針狀結(jié)晶,易溶于水和甲醇,不
溶于二氯甲烷和三氯甲烷。化學(xué)名稱為3—羥基環(huán)丁—3—烯—1,2 二酮,在自然界通常以鈉鹽或鉀鹽的形式存在
(見圖1)。MON對動物有較強(qiáng)的毒性作用,主要作用于增值活躍的細(xì)胞,如肝、脾、心肌、骨骼肌和軟骨細(xì)
胞等。抑制細(xì)胞蛋白合成干擾細(xì)胞分裂增殖,對生物膜通透性和各種酶活性有明顯影響,同時引起機(jī)體過氧化損傷
。動物MON中毒的癥狀主要表現(xiàn)為進(jìn)行性肌無力、呼吸困難、共濟(jì)失調(diào)、全身紫紺、昏迷直到死亡。動物的特征
性損害時心血管系統(tǒng)。小雞表現(xiàn)為發(fā)生腹水,腸系膜腫脹、出血、心臟肥大,心肌細(xì)胞變性壞死,心肌線粒體增
多、腫脹。
白細(xì)胞介素—2主要是在促有絲分裂素或特異性抗原刺激下,由T淋巴細(xì)胞或T淋巴細(xì)胞系產(chǎn)生的在機(jī)體免疫反應(yīng)中
具有重要調(diào)節(jié)作用的一種淋巴因子。1976年Morgan首先在鼠脾淋巴細(xì)胞培養(yǎng)上清液中發(fā)現(xiàn)了IL-2,因其可促進(jìn)和維持T
淋巴細(xì)胞的生長,故被稱為T細(xì)胞生長因子(T cell growth factor,TCGF),1979年被統(tǒng)一命名為IL-2。 IL-2可以促進(jìn)
某一特定T細(xì)胞群體的克隆性擴(kuò)增,通過T淋巴細(xì)胞數(shù)目及功能額提高來增強(qiáng)基體的免疫功能。此外,IL-2還具有誘導(dǎo)
或增強(qiáng)細(xì)胞毒性細(xì)胞的殺傷活性,協(xié)同刺激B淋巴細(xì)胞增值與分泌Ig,增強(qiáng)活化的T淋巴細(xì)胞產(chǎn)生干擾素,誘導(dǎo)淋巴細(xì)
胞產(chǎn)生IL-2等功能。鑒于IL-2具有重要的免疫調(diào)節(jié)功能,IL-2一直是細(xì)胞因子研究的熱點之一。
梁慶紅、張亞超(2004)的實驗結(jié)果表明,IL-2是T淋巴細(xì)胞增值所必需的。T細(xì)胞功能缺陷是因產(chǎn)生IL-2能力喪
失所致。IL-2分泌減少,機(jī)體在細(xì)胞因子水平上的特異性免疫功能下降。王文君等(2000)的研究表明,一些霉菌毒素
能使淋巴細(xì)胞生成減少,能抑制T淋巴細(xì)胞產(chǎn)生白細(xì)胞介素-2及其他淋巴因子數(shù)量減少或機(jī)能降低,抑制白細(xì)胞和補(bǔ)體
C3、C4的生成,降低抗體的產(chǎn)生,影響體液免疫,引起細(xì)胞免疫能力降低,從而影響機(jī)體免疫功能,最終導(dǎo)致T、B淋
巴細(xì)胞數(shù)的改變。
本試驗測定雞血清中白介素2的含量,是為了證實MON對雞的毒害作用,檢測MON對雞免疫功能的影響,為經(jīng)理
畜禽的疾病防治提供一定的理論依據(jù)。
1材料與方法
1.1材料
1.1.1 串珠鐮刀菌:從廣州某飼料廠原料(玉米)種分離的串珠鐮刀菌作為本實驗產(chǎn)毒菌株。
1.1.2 培養(yǎng)基的配置 稱取10g瓊脂培養(yǎng)基粉,用雙蒸水定容至1L,115℃高壓滅菌30min。
1.1.3 主要儀器與設(shè)備
3k30型高速冷凍離心機(jī)(德國SIGMA公司),wFJ-15/20型微粉碎機(jī)(江陰祝塘金益藥化機(jī)械廠),R204B3 旋轉(zhuǎn)蒸
發(fā)儀(上海申生科技有限公司),JA5003N電子分析天平(上海精密科學(xué)儀器有限公司),SZ45-ST1顯
微鏡(東莞沃德普儀器有限公司),PYX-2505A生化培養(yǎng)箱(廣東科力儀器設(shè)備有限公司),SHA-8震蕩搖床(江
蘇宏華儀器廠)。
1.2 方法
1.2.1 串珠鐮刀菌的培養(yǎng)
將試驗菌株接種于瓊脂培養(yǎng)基培養(yǎng) 2 天,待菌株大量生長后,再以滅菌玉米粉為培養(yǎng)基.每250g干燥玉米粉
加水240mL,拌勻,裝入1000mL錐形瓶中,在1kg/cm2高壓滅菌45min, 冷卻后接種產(chǎn)毒菌株,25℃培養(yǎng)10 天,轉(zhuǎn)4℃培養(yǎng)7 天
,再轉(zhuǎn)25℃培養(yǎng)10 天.
1.2.2 串珠鐮刀菌素的提取與純化
經(jīng)過 27 天的培養(yǎng),選擇串珠鐮刀菌生長良好的錐形瓶(生長良好的串珠鐮刀菌的瓶壁 為紫紅色,玉米粉培養(yǎng)
基表面布滿菌絲。由于操作不當(dāng)而污染的串珠鐮刀菌培養(yǎng)基顏色不一,生長較差,以予舍棄),將其在1kg/cm2
高壓滅菌15min,倒出、烘干,將培養(yǎng)物置于WFJ-15/20 型微粉碎機(jī)中進(jìn)行粉碎。然后,粉碎后的培
養(yǎng)物稱取20 g置于300 ml具塞錐形瓶中,加入150 ml二氯甲烷振蕩2 min,過濾棄去二氯甲烷,再加1
50 ml二氯甲烷振蕩 15 min,同樣棄去二氯甲烷。
然后向樣品中加入100 ml乙腈:水((95 : 5)振蕩30 min,過濾, 收集濾液50 ml于250 ml分液漏斗中,加入同體
積的正己烷振搖2 min,待分層后棄去正己烷層,將乙腈水層再分別用20 ml正己烷提取兩次,收集乙
腈水層于梨形瓶中,于小于50℃水浴中旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)減壓蒸干,加入0. 5 ml甲醇溶解殘渣,作為供薄層色譜測定用。
1.2.3 薄層色譜測定
(1)薄層板制備 取硅膠5g加水15ml,涂布于10cm X 10cm 玻璃板上,一次涂成5塊,厚度為0.25mm,
陰干后,
115℃活化1.5h,放干燥器中備用(3天后使用時需重新活化)。
(2)在距底邊為3 cm 處用微量進(jìn)樣器滴加10 mg/L 標(biāo)準(zhǔn)液8 u1與10 u1兩個點及兩個樣液點,每點10 u1,在
展開劑中展
開后取出揮干,噴以1%酚試劑的甲醇溶液,在120℃烘箱中烤30 min。觀察結(jié)果對比標(biāo)準(zhǔn)發(fā)現(xiàn)樣品為陽性,
即樣品含有串珠鐮刀菌素。
1.3 動物試驗
1.3.1 對雞的攻毒
(1)雛雞與分組 取60 只2 日齡健康雛雞,隨機(jī)等分2 組,中毒組日糧中用30%的含毒培養(yǎng)物取代同等量的
正常玉米飼料,MON 含量為76.98mg/kg。對照組不加培養(yǎng)物。二組 在相同條件下飼養(yǎng)55d。
(2)病理學(xué)檢查
試驗期間的死亡雞和試驗結(jié)束時迫殺的全部實驗雞,進(jìn)行大體病理學(xué)檢查,并采心、肝、 肺、腎、腦、脾、甲狀
腺、胃腸及膽囊等組織,10%福爾馬林固定,石蠟切片,H .E 染色 及心肌另進(jìn)行酸性復(fù)紅染色,光鏡檢查。
1.3.2 測定雞血清中白介素2的含量
IL-2(白介素2)酶聯(lián)免疫檢測試劑盒,購自深圳晶美生物工程有限公司。嚴(yán)格按照試劑盒說明操作進(jìn)行測
定.
2 結(jié)果
2.1 中毒癥狀
中毒組在第15d 出現(xiàn)精神沉郁,食欲減退,腹瀉,以醬油色稀糊糞為主。第20d 開始死亡,20-25d 死
亡率較高。以后逐漸消瘦,生長遲緩,繼之羽毛粗亂,呼吸急促,最后不食,站立困難,昏迷而死。中毒
組總死亡率為70% (21/30只)。試驗第35 d 時,中毒組平均體重233g,對照組為388 g,中毒組比對照組
低155 g 。
2.2 病理組織學(xué)檢查結(jié)果
(1)剖檢變化:主要病變?yōu)樾募∷绍?,心室擴(kuò)張,有的心臟橫徑增大,心房擴(kuò)張淤血,心內(nèi)膜有明顯的針尖
狀出血點;肝
臟稍腫大,深紅色,表面有出血點或出血斑,部分雛雞肝臟質(zhì)地較硬;膽囊擴(kuò)張,充滿膽汁;肺淤血,腎淤血或
出血;腸壁變薄
部分雞腸道出血或腸壁有出血斑??偟膩砜?,自然死亡雞比迫殺雞肉眼觀察病變嚴(yán)重。對照組無明顯肉眼變
化。
(2)組織病理學(xué)變化:中毒組病變主要表現(xiàn)為:
心臟:心肌以顆粒變性和空泡變性為主,嚴(yán)重者表現(xiàn)為凝固性壞死,壞死常呈灶狀內(nèi)膜血管淤血、出血,血
管周圍肌纖維壞
死較嚴(yán)重,水腫,肌纖維溶解,被結(jié)締組織取代。
肝臟:肝細(xì)胞索排列紊亂,肝細(xì)胞彌漫性顆粒變性和空飽變性,尤以空飽變性多見,部分肝細(xì)胞呈灶狀變性
壞死,細(xì)胞核固
縮濃染或崩解消失。竇狀隙及中央靜脈擴(kuò)張、淤血。
肺臟:淤血明顯,小靜脈和毛細(xì)血管擴(kuò)張,充滿紅細(xì)胞。
腎臟:腎小球毛細(xì)血管擴(kuò)張、充血。近曲小管上皮細(xì)胞嚴(yán)重顆粒變性或空泡變性,細(xì)胞 破裂,管腔內(nèi)填充粉
紅色物質(zhì)。遠(yuǎn)曲
小管上皮細(xì)胞嚴(yán)重空泡變性,胞質(zhì)幾乎被空替,僅存細(xì)胞核。間質(zhì)血管擴(kuò)張淤血。
腺胃及腸:粘膜絨毛上皮輕度脫落溶解,有少量嗜中性白細(xì)胞浸潤。
脾、甲狀腺等及對照組各臟器均無明顯異常變化。
(3)心肌酸性復(fù)紅染色結(jié)果:中毒組心肌纖維呈紅色條狀或不整的斑條狀,酸性復(fù)紅強(qiáng) 陽性反應(yīng)區(qū)主要分布
在左心室肌、心內(nèi)
膜層及房室結(jié)處,嚴(yán)重者整個心肌呈陽性反應(yīng)。正 常肌纖維及對照組心肌均呈藍(lán)綠色。
2.3 試驗期雞的體重及免疫器官重量變化見表2。
表1 雞只體重變化( X ±S.E.) 單位(g) 日齡 對照組 試驗組 15 52.5±6.89 a 49.17±2.04 a 27 233.17±19.03 a 110.83±8.01 b 35 381.67±30.11 a 228.33±30.11 b 45 723.33±
59.97 a 471.67±22
.51 b 55 1085.67±96.66 a 721.67±61.05 b 注:表中數(shù)據(jù)為平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤( X ±S.E.);同一行數(shù)字右上角小寫
字母間不同表示差 異顯著(P<0.05)。
表2 雞免疫器官指數(shù)( X ±Se) 單位(g/kg) 日齡 對照組 試驗組 ♂ ♀ ♂ ♀ 27 脾臟 1.743±0.228 a 1.836
±0.2 a 1.66±0.592 b 1.676±0.387 b 胸腺 4.934±0.184 a 4.982±0.265 a 4.773±0.497 b 3.175±0.348 b 法氏囊 3.724±0.141 a 3.584±0.193 a 3.331±0.780 b 2.444±0.639 b 35 脾臟 1.703±0.032 a 1.717±0.114 a 1.543±0.184
b 1.619±0.283 b 胸腺 4.446±0.016 a 4.281±0.479 a 3.398±0.197 b 3.44±0.524 b 法氏囊 3.448±0.559 a 3.307±0.840 a 2.931±0.755 b 3.266±0.197 b 45 脾臟 1.52±0.257 a 1.634±0.245 a 1.495±0.205
b 1.502±0.155 b 胸腺 3.993±0.148 a 4.231±0.547 a 2.632±0.009 b 2.346±0.071 b 法氏囊 2.216±0.356 a 2.139±0.834 a 2.079±0.261 b 2.088±0.073 a 55 脾臟 1.397±0.547 a 1.417±0.221 a 1.173±0.130
b 1.207±0.032 b 胸腺 3.252±1.200 a 3.713±2.420 a 2.097±0.286 b 2.235±0.373 b 法氏囊 2.134±0.184 a 2.071±0.233 a 1.894±0.074 b 1.696±0.077 b 注:免疫器官指數(shù)為各器官相對于小雞體重的比值,
單位為“g/kg”。表中數(shù)據(jù)為平均 3 數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤( X ±S.E.);同一行數(shù)字右上角小寫字母間不同表示差異顯著
(P<0.05)。
2.4 雞血清中白介素2 的含量 表2-3 雞血清白介素-2 含量測定結(jié)果(X ±S.E.) (ng/ml) 日齡 對照組 試驗組 15 0.000 0.000 27 0.000 0.000 35 1.163±0.048 a 1.047±0.033 b 45 1.667±0.244 a 0.887±0.435 b 55 2.193±0.166
a 0.525±0.575 b 注:表中數(shù)據(jù)為平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤( X ±S.E.);同一行數(shù)字右上角小寫字母間不同表示差 異顯
著(P<0.05)。 圖1 雞血清中白介素-2 含量的變化趨勢
3 討論 3.1IL-2 是T 淋巴細(xì)胞增殖所必需的。IL-2 由活化的T 細(xì)胞產(chǎn)生,介導(dǎo)和調(diào)節(jié)特異性免疫 應(yīng)答,是對機(jī)體
免疫系統(tǒng)具有較強(qiáng)調(diào)節(jié)作用的細(xì)胞因子,在免疫應(yīng)答過程中可促進(jìn)T、B 淋 巴細(xì)胞的活化、增生和分化,促進(jìn) N
K 細(xì)胞增殖及增強(qiáng)其殺傷活性,是免疫反應(yīng)的中心環(huán) 節(jié)。從表2-1 可知,飼喂含有MON 的雞在15 日齡時與對照
組雞的體重差異不顯著(P>0.05), 在 27、35、45、55 日齡時體重發(fā)生了明顯變化,對照組與試驗組的雞體重
差異極顯著 (P<0.01),隨著日齡的增加,試驗組雞的體重也在增加,但增長緩慢沒有對照組雞增長快, 這說
明MON 會影響雞的生長速度 3.2 免疫器官稱重法是目前研究機(jī)體免疫體況的方法之一。一般認(rèn)為免疫器官重量
降低為免 疫抑制所致,而免疫器官重量增加則為免疫增強(qiáng)的表現(xiàn)(王國杰,1994)。從表2-2 可以看 出,♀胸腺
、脾臟指數(shù)在27、35、45、55 日齡時試驗組較對照組降低明顯,差異顯著(P<0.05), 法氏囊指數(shù)在27、55 日齡
時對照組較試驗組明顯偏高,差異顯著(P<0.05),在35、45 日 齡時對照組與試驗組無明顯差異(P>0.05);♂
胸腺、脾臟、法氏囊指數(shù)對照組較試驗組有 所偏高,差異顯著(P<0.05)。這說明飼料中含有MON 對免疫器官的
重量有減輕的趨勢。
3.3 從表2-3,圖2-1 可知 在雞15、27 日齡時,對照組和試驗組中均未測出白介素-2 的含 4 量;35、45、55 日齡
時對照組雞血清中白介素-2 含量有逐漸增高的趨勢,而試驗組中白介 素-2 含量有降低的趨勢。在35、45、55 日齡
時,對照組和試驗組雞血清中的白介素-2 含 量差異極其顯著(P<0.01)。
3.4 結(jié)果表明,在15、27 日齡時,對照組、試驗組均未能在雞血清中測出有白介素-2,這 可能與血清中IL-2 含
量太少以及小齡雛雞血清中生成IL-2 含量少有關(guān)系;35、45、55 日 齡雞血清中IL-2 的含量,對照組隨著日齡的
增加而有所增加,試驗組則有降低的趨勢,這 說明試驗組雞IL-2 的分泌受到抑制,機(jī)體在細(xì)胞因子水平上的特
異性免疫功能下降。由前 面結(jié)果所知:MON 影響機(jī)體免疫器官指數(shù)的生長發(fā)育,血液中T 淋巴細(xì)胞比例下降、T
淋巴 細(xì)胞轉(zhuǎn)化率降低,這些也是引起IL-2 分泌減少的原因;MON 影響抗體生成,影響體液免疫、 細(xì)胞免疫能力
降低,從而影響機(jī)體免疫功能;而MON 與IL-2 分泌多少的作用機(jī)理還尚待進(jìn) 一步探討。血清中 NO 含量和 IL-2
含量沒有明顯的相關(guān)性,至于 MON 對二者在免疫調(diào)節(jié)方 面的作用機(jī)制還需進(jìn)行下一步的研究探討。
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